Cromatografia su colonna

La cromatografia (dal greco χρῶμα, traslitterato in khrôma, “colore”), è una tecnica di separazione delle componenti di una miscela omogenea basata sulla distribuzione dei suoi componenti tra due fasi, una stazionaria e una in movimento lungo una direzione definita. Nella cromatografia su colonna la direzione va dall’alto verso il basso ed è dettata da un tubo di vetro (la colonna).

La cromatografia su colonna è una particolare tecnica cromatografica che si basa sulla proprietà che hanno alcune sostanze, una volta sciolte in opportune soluzioni, di interagire con una matrice solida opportunamente preparata. Vedrò di spiegarti meglio cosa significa quanto ho appena scritto!

Cromatografia su colonna: cos’è

Non è altro che un metodo di separazione cromatografica che si attua in una colonna di vetro. Tale tecnica sfrutta differenza di carica, di grandezza, di affinità di legame o altre proprietà della componente da isolare per creare bande dalle caratteristiche diverse.

Nelle foto riportate in questa pagina, ti mostriamo le sequenze della cromatografia su colonna e in particolare dell’estrazione dell’eluito, cioè la sostanza “parzialmente purificata” che esce dal beccuccio terminale della colonna di vetro.

La cromatografia su colonna è molto utile per la purificazione delle proteine e per la separazione di un gran numero di sostanze da esaminare singolarmente. A volte, le sostanze isolate con cromatografia su colonna perdono le proprietà che avevano all’interno della miscela. Tutto dipende dalla tecnica di cromatografia su colonna e dalla sostanza che si vuole purificare.

Cromatografia su colonna: come funziona

Un tubo di vetro viene riempito da un materiale solido poroso, definito “fase stazionaria“. La fase stazionaria presenta proprietà chimiche opportune scelte in base alla sostanza che si vuole purificare / separare dalla miscela. La colonna viene poi riempita con una soluzione tampone, anche questa opportunamente formulata. La soluzione tampone è detta “fase mobile” e contiene la miscela che si vuole separare.

La miscela da separare è disciolta nella fase mobile. La fase mobile viene quindi stratificata sulla sommità della colonna e fatta percolare attraverso la fase stazionaria (la matrice solida). In questo modo, la soluzione diffonde lungo la colonna e forma una banda continua lungo tutta la fase stazionaria. Le sostanze che eluiscono (escono) dalla colonna hanno proprietà specifica in base all’ordine di elusione.

Per capirci meglio, facciamo l’esempio della purificazione delle proteine, anche se la fase mobile può essere rappresentata da qualsiasi miscela. Avremo che le singole proteine eluiscono dalla colonna più o meno velocemente in base alle loro proprietà.

In base al tipo di fase stazionaria, abbiamo diverse tecniche di cromatografia su colonna, quali:

• Cromatografia a scambio ionico
• Cromatografia per esclusione molecolare
• Cromatografia per affinità

Non manca poi una tecnica più costosa che sfrutta l’alta pressione, vale a dire la cromatografia liquida ad alta pressione o HPLC.

Cromatografia a scambio ionico

Nella cromatografia a scambio ionico la matrice solida (fase stazionaria) è ricca di cariche positive o negative. Va da sé che la cromatografia a scambio ionico sfrutta le differenze del tipo e dell’intensità di carica elettrica netta a un certo pH.

In questo caso, la fase stazionaria è un polimero sintetico (resina) contenente gruppi carichi negativamente (quindi si parla di scambiatori di cationi) o gruppi carichi positivamente (si parla di scabiatori di anioni).

Tornando all’esempio della purificazione delle proteine, la differenza di carica è legata alla presenza di amminoacidi con determinati gruppi funzionali. L’affinità di ciascuna proteina per i gruppi carichi della colonna dipende dal pH che a sua volta incide sullo stato di ionizzazione dei gruppi funzionali degli amminoacidi costituenti.

Nella cromatografia su colonna la soluzione che si prepara per la fase mobile è fondamentale. Nel nostro esempio con le proteine, la concentrazione salinae il pH possono creare un gradiente che può favorire l’estrusione di determinate proteine.

Cromatografia ionica: scambio cationico

Nel caso della cromatografia ionica con matrice a scambio cationico, la matrice solida possiede gruppi carichi negativamente quindi le proteine con carica netta positiva saranno le ultime ad effluire dalla colonna. I primi composti a uscire dalla colonna saranno quelli con una forte carica netta negativa (per repulsione dalla matrice), poi usciranno sostanze con carica negativa parziale. Le sostanza da eluire si muoveranno attraverso la colonna con una velocità dipendente dalla loro carica netta nella soluzione utilizzata.

Cromatografia per esclusione molecolare

In questo caso, la miscela (fase mobile) viene aggiunta in una colonna contenente un polimero con legami crociati e le molecole da isolare saranno separate per dimensione. Istintivamente viene da pensare che le molecole più piccole usciranno per prime dalla colonna ma in realtà è l’esatto opposto.

Le molecole più grosse saranno costrette a percorrere il tragitto più breve fino al termine della colonna. Per diffusione, le molecole più piccole saranno libere di penetrare nei pori della matrice solida impiegando più tempo per eluire. Il primo eluito raccolto sarà quello che detiene le molecole più grosse.

Cromatografia su colonna per affinità

Nella fase stazionaria è presente un ligando. Quando la soluzione da separare attraversa la colonna, le molecole che presentano affinità per quel ligando formeranno un legame specifico. Le sostanze di interesse si terrà nelle prime o nelle ultime frazioni raccolte in base al tipo di legando usato.

Cromatografia liquida ad alta pressione

Le tecniche di cromatografia su colonna appena descritte possono avere una risoluzione discreta delle bande. Il motivo? Ogni sostanza tende a diffondere dopo un certo tempo.

Utilizzando pompe ad alta pressione, aumenta la velocità e diminuiscono i tempi impiegati dalle molecole a percorrere la colonna. In questo contesto sono necessarie matrici cromatografiche in grado di sopportare forti pressioni.

Riducendo il tempo di transito attraverso la colonna, la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) limita la diffusione delle bande e migliora notevolmente la risoluzione dell’eluito raccolto.

Pubblicato da Anna De Simone il 17 Novembre 2018